細(xì)胞繼代培養(yǎng)

前言：
1. 細(xì)胞生長(zhǎng)至高密度時(shí)，即須收集細(xì)胞，分殖至新的培養(yǎng)瓶中，其稀釋比例依細(xì)胞種類而異。
2. 收集細(xì)胞方法可用trypsin-EDTA、cell scraper、離心處理等，處理方法依細(xì)胞種類而異。
3. Trypsin-EDTA為收集吸附型細(xì)胞常用之方法。 Trypsin為胰蛋白酵素，其作用為分解細(xì)胞與瓶壁之附著蛋白， EDTA為chelating agent，其作用為去除Ca2+、Mg2+等離子，trypsin與EDTA二者共同作用，可使附著之細(xì)胞自瓶壁脫落。除了trypsin-EDTA，亦可使用cell scraper（細(xì)胞刮勺）刮落細(xì)胞。
4. Trypsin-EDTA作用時(shí)間勿太久，否則可能對(duì)細(xì)胞造成傷害或死亡。敲拍培養(yǎng)瓶不可太過猛烈，避免對(duì)細(xì)胞造成傷害或造成培養(yǎng)瓶裂痕而污染。
材料：
1. Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free
2. trypsin-EDTA solution （0.05% trypsin-0.53mM EDTA.4Na）：若為大體積包裝，建議將其以少量分裝于無菌試管中，保存于-20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機(jī)會(huì)。使用前放在37°C水槽中回溫。
3. 新鮮培養(yǎng)基
4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶。
步驟：
1. 附著型細(xì)胞（adherent cell）
  1. 吸掉舊培養(yǎng)液。
  2. 用Dulbecco's phosphate-buffered saline洗滌細(xì)胞一至二次。
  3. 加入trypsin-EDTA溶液（1ml/T-25 flask， 2ml/T-75 flask）：
    1. 方法一：37°C或室溫作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA溶液，輕敲培養(yǎng)瓶邊緣使細(xì)胞自瓶壁脫落，然后加入適量之新鮮培養(yǎng)基，與脫落之細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，依正常條件繼續(xù)培養(yǎng)之。
    2. 方法二：37°C或室溫作用數(shù)分鐘，待細(xì)胞自瓶壁脫落后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基，以終止trypsin作用（因血清中含有trypsin inhibitor，可以終止trypsin作用），離心后去除上清液，或不作離心處理，添加新鮮培養(yǎng)基后依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，依正常條件繼續(xù)培養(yǎng)之。
2. 懸浮型細(xì)胞（suspension cell）
  1. 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm、 5分鐘。
  2. 吸除上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，與沉淀細(xì)胞（cell pellet）混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，依正常條件繼續(xù)培養(yǎng)。
3. 融合瘤（hybridoma）
  1. 有些hybridoma cell需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可能會(huì)失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。

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